NAGY Ferenc
kutatóprofesszor, laborvezető

SZEKERES Miklós	tudományos tanácsadó
KOZMA-BOGNÁR László	tudományos főmunkatárs
ÁDÁM Éva	tudományos főmunkatárs
FEJES Erzsébet	tudományos főmunkatárs
VICZIÁN András	tudományos munkatárs
HAJDU Anita	tudományos segédmunkatárs
TERECSKEI Kata	tudományos segédmunkatárs
HATEGAN Lídia	doktorjelölt kutató

GODZA Blanka	doktorjelölt kutató
SIPOS Márk György	Ph.D. hallgató
MENCZEL László	tudományos ügyintéző
BERNULA Péter	tudományos ügyintéző
PETHŐNÉ JÓSZAI Katalin	laboratóriumi asszisztens
KOÓSNÉ MAJZIK Hedvig	laboratóriumi asszisztens
HAJÓ Róbertné	laboratóriumi asszisztens
SZABÓNÉ VERES Gabriella	laboratóriumi asszisztens

FÉNY, CIRKADIÁN ÓRA ÉS NÖVÉNYI HORMONOK ÁLTAL SZABÁLYOZOTT JELÁTVITELI HÁLÓZATOK MOLEKULÁRIS ALAPJAI

A növények fejlődéséhez elengedhetetlenül fontosak azok a jelátviteli folyamatok, amelyek a külső környezet pillanatnyi állapotáról közvetítenek információt. A fény, cirkadián óra és hormonális szabályozást megvalósító jelátviteli utak kölcsönhatása egy olyan regulációs hálózatot hoz létre, amely segíti a növényeket a változó körülményekhez való alkalmazkodásban. Csoportunk (i) az ultraibolya fény által aktivált jelátviteli utak felépítését, (ii) a vörös/távoli-vörös fényt érzékelő fotoreceptorok működésének molekuláris mechanizmusát, (iii) a növényi cirkadán óra szerkezetét és funkcióját, (iv) valamint a szteroid növényi hormonok (brasszinoszteroidok) bioszintézisének kulcs-enzimjeit kódoló gének kifejeződésének szabályozását vizsgálja a lúdfű (Arabidopsis thaliana) modellnövényben.

Az ultraibolya fény hatását közvetítő jelátviteli utak

Az ultraibolya fény (UV) a napfény egyik biológiai szempontból jelentős és dinamikusan változó tartománya. Az UV fény DNS-károsító hatása már régóta ismert, de az utóbbi évek egyre több kísérleti eredménye bizonyítja, hogy az UV sugárzás nemcsak stressz-válaszokat vált ki, hanem a spektrum látható tartományába eső fényhez hasonlóan egyfajta környezeti jelként szabályozza a növények fejlődését. Munkánk során megállapítottuk, hogy rövid ideig tartó alacsony intenzitású (nem károsító) UV fény pulzusok jellegzetes változást idéznek elő több száz Arabidopsis gén kifejeződésének mintázatában. Roman Ulm kutatócsoportjával (Freiburg, Németország) együttműködve kimutattuk, hogy a bZIP típusú HY5 (LONG HYPOCOTYL 5) transzkripciós faktor, a COP1 (CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1) ubiquitin ligáz és az UVR8 (ULTRAVIOLET RESISTANT 8) fehérjék azok a kulcs-faktorok, amelyek meghatározó szerepet játszanak e specifikus UV-válasz kialakításában. Kimutattuk továbbá, hogy az UV megvilágítást követően a COP1 és UVR8 fehérjék nagyon gyorsan kapcsolódnak egymáshoz a növényi sejtekben és igazoltuk, hogy e kölcsönhatás kialakulása elengedhetetlen fontosságú a növényi UV-válaszok megjelenéséhez. Főbb céljaink között szerepel az UV-indukált jelátviteli hálózat további elemeinek azonosítása, valamint azoknak a specifikus promóter elemeknek a meghatározása, amelyek, mint a jelátviteli lánc utolsó elemei, UV-függő módon szabályozzák adott gének transzkripcióját. Mivel az UV és a látható fény által indukált jelátviteli hálózatok számos központi fontosságú komponense közös (pl. HY5, COP1), vizsgálni kívánjuk, hogy milyen hatással van az UV sugárzás a fitokróm fotoreceptorok és a cirkadián óra által szabályozott jelátviteli folyamatok aktivitására.

A fitokróm fotoreceptorok által szabályozott jelátviteli folyamatok

A fitokróm fotoreceptorokat egy öt tagból álló géncsalád (PHYA,B,C,D,E) kódolja Arabidopsis-ban. A fitokróm molekulák fényérzékelésének alapját az az egyedülálló képességük adja, hogy a biológiailag inaktív (vörös fényt elnyelő) és az aktív (távoli vörös fényt elnyelő) konformációs változatok vörös, ill. távoli vörös fény hatására reverzibilisen alakulnak egymásba. A fitokrómok fényindukált konformáció változása jelenti az elsődleges jelet, amely 2500-3000 gén kifejeződésének gátlása vagy serkentése révén végső soron a fényfüggő növényi életfolyamatokat irányítja. Kimutattuk, hogy a sötétben a citoplazmában elhelyezkedő inaktív fitokróm receptorok a fény elnyelését követően a sejtmagba importálódnak, ahol ún. sejtmagi testeket formálnak (1. ábra). Bár a sejtmagi testek biológiai szerepe még nem tisztázott, feltételezzük, hogy olyan fitokrómokat is tartalmazó fehérje-komplexek megjelenési formái, amelyek közvetve, vagy közvetlenül irányítják a fényszabályozott gének egy részének kifejeződését. Csoportunk számos molekuláris és sejtbiológiai módszert alkalmaz annak felderítésére, hogy a sejtmagi testek pontosan milyen szerepet játszanak a fény-indukált jelátviteli folyamatokban.

1. ábra: PHYA, B, C, D, E-GFP fúziós fehérjéket tartalmazó sejtmagi testek fényfüggő kialakulása sötétben nevelt növények sejtjeiben.
[A]-[J]: Fluoreszcens képek olyan transzgenikus Arabidopsis növények hipokotil sejtjeiről, amelyek a PHYA-GFP ([A] és [B]), PHYB-GFP ([C] és [D]), PHYC-GFP ([E] és [F]), PHYD-GFP ([G] és [H]), vagy PHYE-GFP ([I] és [J]) fúziós fehérjéket termelnek. Az [A], [C], [E], [G], és [I] felvételek sötétben nevelt növények sejtjeiről készültek, míg a [B] panel 10 perces, a [D], [F], [H] és [J] panelek pedig 6 órás fénykezelés hatását mutatják. A sejtmagok helyzetét ‘nu ’ felirat jelzi.

Kimutattuk, hogy az FHY1 (FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL 1) és közeli homológja, az FHL1 (FHY1-LIKE) fehérjék szükségesek és elégségesek a PHYA receptor fényfüggő sejtmagi importjának szabályozásához. Adataink alapján és a PHYA és FHY1 fehérjék, mint építő elemek felhasználásával egy olyan mesterséges fényindukált sejtmagi import és génexpressziós rendszert kívánunk létrehozni, amely egyaránt használható növényi, élesztő, vagy akár emlős sejtekben is.

A fény-aktivált PHYA molekula rendkívül instabil fehérje, fél-életideje mindössze 20 perc. Azok a faktorok, amelyek ezt a gyors fényindukált lebomlási folyamatot irányítják, nem ismertek. Az elmúlt években egy genetikai szűrést hajtottunk végre, amely során olyan mutánsokat azonosítottunk, amelyekben egy transzgénről kifejeztetett PHYA-luciferáz (PHYA-LUC) fúziós fehérje fényben mérhető stabilitása jelentősen megnőtt (2. ábra). Igazoltuk, hogy a mutánsokban az endogén PHYA fényindukált lebomlása hasonló mértékben sérült. A mutánsok további jellemzése és a mutációt hordozó gének azonosítása várhatóan a növényi fényindukált fehérje-lebomlás új szabályozó elemeinek felfedezéséhez vezet.

2. ábra. A PHYA-LUC fúziós fehérje fényindukált lebomlása két azonosított mutánsban.
A panel: lumineszcens felvételek sötétben nevelt (cD) majd 6 órás fénykezelést kapott (R) növényekről. A PHYA-LUC fehérjeszinttel arányos lumineszcencia intenzitás fény hatására bekövetkező jelentős csökkenése csak a vad típusú (WT) növényekben figyelhető meg, míg a két bemutatott mutánsban (225/1 és 005-7A) a fényindukált lebomlás láthatóan zavart szenvedett.
B panel: a PHYA-LUC fúziós fehérjék fényindukált lebomlásának kinetikája. A fent említett sötétben nevelt növényeket a kísérlet kezdetén (0 időpont) fénybe helyeztük, majd a jelzett időpontokban meghatároztuk a lumineszcencia intenzitást. A kapott értékeket a kiindulási (sötétben mért) szintre vonatkoztattuk.

A cirkadián óra felépítésének és működésének vizsgálata Arabidopsis thaliana-ban

A cirkadián óra egy olyan 24 órás periódussal működő biológiai oszcillátor, amely ritmikusan szabályoz számos molekuláris és élettani folyamatot szinte minden olyan élőlényben, amelyek a nappalok és éjszakák váltakozásának vannak kitéve. Az eukarióta cirkadián órák működése az ún. óragének és az általuk kódolt órafehérjék közt fennálló transzkripció-transzláció szintű negatív visszacsatoláson alapul. Az órakomponensek által létrehozott alap-ritmust specifikus bemeneti jelek szinkronizálják a napi rendszerességű környezeti változásokhoz, amelyek a nappalok és éjszakák törvényszerű váltakozását kísérik. A legfontosabb beállító jel a fény, amelyet a fitokróm fotoreceptorok érzékelnek és továbbítanak a cirkadián oszcillátorhoz. Kimutattuk, hogy a cirkadián óra ritmikusan szabályozza a fitokróm gének kifejeződését és a fényaktivált fitokrómok sejtmagi importját is. Eredményeink alapján elsőként bizonyítottuk, hogy a cirkadián oszcillátor és a fény-bemeneti oldal komponensei között fennálló kölcsönös, kétirányú szabályozást.

A cirkadián óra újabb elemeinek azonosítása céljából genetikai szűrést végeztünk, amelynek során számos új óra-mutánst izoláltunk Arabidopsis-ban. Ezek közül a lip1 (light insensitive period 1) olyan új cirkadián fenotípust mutat, amely fény-bemeneti oldal funkciójának speciális sérülésére utal. A LIP1 gén egy működőképes, növény-specifikus kis GTP-kötő fehérjét kódol, amely valószínűleg a transzlációt követően, fehérje-szinten hat valamely órakomponensre. Jelenlegi munkánk célja a LIP1 molekuláris hatásmechanizmusának felderítése, amely lehetővé teszi a LIP1 elhelyezését a növényi cirkadián óra aktuális modelljében.

A további mutánsok vizsgálata és jellemzése várhatóan hozzájárul a cirkadián órát felépítő genetikai szabályozó körök számának és szerkezetének megismeréséhez.

A brasszinoszteroid bioszintézis szabályozása

A brasszinoszteroidok (BR-ok, növényi szteroid hormonok) fontos szerepet játszanak a növények növekedésének, fényfüggő fejlődésének, csírázásának, virágzásának és termékenységének szabályozásában. A szteroid hormonszint kialakítása nagymértékben függ a bioszintézisükért felelős gének aktivitásától, ami alapvetően transzkripciós szinten meghatározott. Arabidopsis növényekben a bioszintézisért felelős összes gén működését a végtermékként keletkező biológiailag aktív BR-ok szintje kontrollálja egy egységes negatív visszacsatolási mechanizmus révén. Emellett legalább két kulcsenzim, a CPD és a BR C-6-oxidáz CYP85A2 génjének expresszióját még fejlődési, szervspecifikus, fényfüggő és napszakos szabályozás is befolyásolja. Mivel a BR-ok keletkezésük környezetében hatnak, ezek a regulációs mechanizmusok esszenciálisak a hormonegyensúly és a megfelelő differenciációs hatás biztosítása szempontjából.

Korábbi eredményeink szerint a hormonszint mellett a BR-érzékenység fényfüggő változásai is meghatározóak a biológiai hatás kiváltásában. Célunk annak tisztázása, hogy e két tényező hogyan, milyen mértékben járul hozzá a BR jelátviteli út aktiválásához. Ennek érdekében a lokális BR szint változásait kívánjuk meghatározni a szervdifferenciációs folyamatok során, valamint tisztázni akarjuk az egyes szignálátviteli komponensek lokális abundanciája és a hormonreakció erőssége közti összefüggést.

Válogatott közlemények

Ulm, R., Baumann, A., Oravecz, A., Máté, Z., Ádam, É., Oakeley, J., Schäfer, E. and Nagy, F. (2004). Genome-wide analysis of gene expression reveals HY5 function in the UV-B response of Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101: 1397-1402.

Oravecz, A., Baumann, A., Máté, Z., Brzezinska, A., Molinier, J., Oakeley, E.J., Ádám, É., Schäfer, E., Nagy, F. and Ulm, R. (2006). CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1 is required for the UV-B response in Arabidopsis. The Plant Cell 18:1975-1990.

Sáfrány, J., Haasz, V., Máté, Z., Ciolfi, A., Fehér, B., Oravecz, A., Stec, A., Dallmann, G., Morelli, G., Ulm, R. and Nagy, F. (2008). Identification of a novel cis-regulatory element for UV-B induced transcription in Arabidopsis. Plant J. 54: 402-414.

Kerényi, Z., Mérai, Z., Hiripi, L., Benkovics, A., Gyula, P., Lacomme, C., Barta, E., Nagy, F. and Silhavy, D. (2008). Inter-kingdom conservation of mechanism of nonsense-mediated mRNA decay. EMBO J. 27: 1585-1595.

Kircher, S., Gil, P., Kozma-Bognár, L., Fejes, E., Speth, V., Bauer, D., Ádám, É., Schäfer, E. and Nagy, F. (2002). Nucleo-cytoplasmic partitioning of the plant photoreceptors phytochrome A, B, C, D and E is differentially regulated by light and exhibits a diurnal rhythm. Plant Cell 14: 1541-1555.

Hiltbrunner, A., Viczián, A., Bury, E., Tscheuschler, A., Kircher, S., Toth, R., Honsberger, A., Nagy, F., Fankhauser, C. and Schäfer, E. (2005). Nuclear accumulation of the phytochrome A photoreceptor requires FHY1. Curr. Biol. 15: 2125-2130.

Kevei, É., Schäfer, E. and Nagy, F. (2007). Light-regulated nucleo-cytoplasmic partitioning of phytochromes, J. Exp. Bot. 58: 3113-3124.

Pfeiffer, A., Kunkel, T., Hiltbrunner, A., Neuhaus, G., Wolf, I., Speth, V., Adam, E., Nagy, F. and Schaefer, E. (2008). A cell free system for light dependent nuclear import of phytochrome. Plant J. 57: 680-689.

Tóth, R., Kevei, E., Hall, A., Millar, A.J., Nagy, F. and Kozma-Bognár, L. (2001). Circadian clock-regulated expression of phytochrome and cryptochrome genes in Arabidopsis. Plant Physiol. 127: 1607-1616.

Dodd, A.N., Salathia, N., Hall, A., Kevei, É., Tóth, R., Nagy, F., Hibberd, J.M., Millar, A.J. and Webb, A.A. (2005). Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage. Science 309: 630-633

Locke, J.C., Kozma-Bognár, L., Gould, P.D., Fehér, B., Kevei. É., Nagy, F., Turner, M.S., Hall, A. and Millar, A.J. (2006). Experimental validation of an expected feedback loop in the multi-oscillator clock of Arabidopsis thaliana. Mol. Syst. Biol. 2: 59.

Kevei, É., Gyula, P., Fehér, B., Tóth, R., Viczián, A., Kircher, S., Rea, D., Dorjgotov, D., Schäfer, E., Millar, A.J., Kozma-Bognár, L. and Nagy, F. (2007). Arabidopsis circadian clock is regulated by the small GTPase LIP1. Curr. Biol. 17: 1456-64.

Bancos, S., Nomura, T., Sato, T., Molnár, G., Bishop, G.J., Koncz, C., Yokota, T., Nagy, F. and Szekeres, M. (2002). Regulation of transcript levels of the Arabidopsis cytochrome P450 genes involved in brassinosteroid biosynthesis. Plant Physiol. 130: 504-513.

Bancos, S., Szatmári, A.-M., Castle, J., Kozma-Bognár, L., Shibata, K., Yokota, T., Bishop, G.J., Nagy, F. and Szekeres, M. (2006). Diurnal regulation of the brassinosteroid-biosynthetic CPD gene in Arabidopsis. Plant Physiol. 141: 299-309.

Ohnishi, T., Szatmári, A.-M., Watanabe, B., Fujita, S., Bancos, S., Koncz, C., Lafos, M., Shibata, K., Yokota, T., Sakata, K., Szekeres, M. and Mizutani, M. (2006). C-23 hydroxylation by Arabidopsis CYP90C1 and CYP90D1 reveals a novel shortcut in brassinosteroid biosynthesis. Plant Cell 18: 3275-3288.