Kutatás - Növénybiológiai Intézet - Funkcionális Sejtbiológia Laboratórium

FUNKCIONÁLIS SEJTBIOLÓGIA

A növények egyedfejlődése helyhez kötött életmódjuk következtében rendkívül rugalmas. A belső (fiziológiai, hormonális) és külső (környezeti) szignálok dinamikus kölcsönhatása biztosítja a növények folyamatos alkalmazkodását a változó környezeti feltételekhez. Laboratóriumunkban azokat a sejtszintű jelátviteli folyamatokat vizsgáljuk molekuláris és sejtbiológiai, valamint biokémiai, módszerekkel, amelyek megalapozzák a növények egyedfejlődésének ezt a nagyfokú rugalmasságát.


ROP GTPÁZ-KAPCSOLT JELÁTVITELI HÁLÓZATOK NÖVÉNYEKBEN

A kutatás rövid ismertetése

A növényi test felépítését alapvetően meghatározza a növényi egyedfejlődés során a sejtek osztódásának, alakjának, növekedésének irányultsága. A növények apikális-bazális polaritása már az egy-sejtes zigótában kialakul, és ez határozza meg a szervezet fő tengelyét, ami a későbbiekben az egyedfejlődési/szervdifferenciálódási mintázat alapjául szolgál. A sejtek növekedési irányát a legtöbb élőlényben hasonló molekuláris folyamatok szabályozzák. Ennek a szabályozásnak a középpontjában minden eukarióta élőlényben, így a növényekben is, a Rho-típusú GTP-kötő fehérjék állnak. A növényi Rho-típusú (ROP) GTPázok szerepét a növényi sejtek poláris növekedésének szabályozásában már számos kísérleti rendszerben igazolták, de a kapcsolódó jelátvitali hálózatokról az ismereteink még nagyon hiányosak. Azt azonban már tudjuk, hogy ezek a mechanizmusok eltérnek azoktól melyeket az állatok illetve az élesztő Rho GTPázok esetében leírtak. Ezzel kapcsolatban laboratóriumunkban már korábban kimutattuk, hogy a RLCKVI_A csoportba tartozó növényspecifikus kinázok potenciális ROP effektorok. Ezek a kinázok állnak jelenleg a vizsgálataink középpontjában, mivel megfigyeléseink szerint szinte az összes ROP GTP-áz függő jelátviteli útban szerepet játszhatnak. Azonban a vizsgálatokat kiterjesztettük a ROP GTPázokat szabályozó kinázokra is. Mutáns és transzgenikus növények, élesztő és in vitro szűrési technikák, tranziens génkifejeződési vizsgálatok, konfokális mikroszkópia és in silico adatfeldolgozás segítségével szerzett biokémiai, szerkezeti, sejtbiológiai és funkcionális információk összegyüjtésén keresztül tárjuk fel a ROP GTPáz-kapcsolt kinázok szerepét a sejtpolaritás szabályozásában a növényi morfogenezis során, gomba fertőzött sejtekben és in vitro növekedő pollencsövekben.


A kutatás fő kérdései

Élesztő és állati sejtekben számos Rho-aktivált kináz (PAK) létezik, míg növényekből ezek a típusú kinázok hiányoznak. Az állati Rho GTPázok kapcsolódása a receptor tirozin kinázokhoz RhoGEF feherjéken keresztül szintén jól ismert. Ugyanakkor a növények speciális, egyedi Rho-típusú GTPázokkal (ROP), receptor kinázokkal (RLK), RopGEF fehérjékkel (PRONE) és ROP-effektor kinázokkal (RLCKVI_A) rendelkeznek. Arról, hogy ezek a növényspecifikus fehérjék milyen jelátviteli kapcsolatban állnak egymással, még alig vannak adataink. Előzetes eredményeink alapján feltételezzük, hogy a fenti fehérjék bonyolult kapcsolatban állnak egymással és együttesen fontos szerepet játszanak különböző folyamatok ROP GTPázok általi szabályozásában. Ezt a hipotézis kívánjuk igazolni változatos kísérleti megközelítéseket felhasználva. Ezen túl, külföldi partnerünkkel, Ralph Hückelhovennel (Müncheni Műszaki Egyetem), együttesen kívánjuk igazolni azt a feltételezést, hogy a kompatibilis biotróf gomba kórokozók a növényi sejtek polaritást szabályozó mechanizmusát használják a sejtekbe való behatolásra. Az a célunk, hogy összehasonlítsuk a ROP- illetve kináz-függő lépéseket a sejtek poláris növekedése (pollen cső) és a gomba kórokozók növénybe hatolása során, azon túl, hogy feltárjuk a ROP-kapcsolt kinázok általános szerepét a növényi egyedfejlődésben.


A kutatás jelentősége

A megszerzett információk alapján egy általános növényi jelátviteli modellt hozhatunk létre (receptortól a ROP effektorig), mely alapul szolgálhat a jelátviteli mechanizmusok evolúciós összehasonlításához illetve olyan alapvető folyamatok megismeréséhez, mint a poláris sejt növekedés, sejtmegnyúlás, növényi morfogenezis valamint a stressz és hormonális válaszreakciók. Ezek az alapvető tudományos ismeretek hosszútávon elvezethetnek olyan molekuláris markerek és technológiák feltárásához, melyek lehetővé teszik a növények alakjának, fejlődésének a megváltoztatását. A kutatások további potenciális jelentőségét az adja, hogy a sejtpolaritást szabályozó mechanizmusok részt vesznek a gombakórokozókkal szembeni érzékenység kialkulásában is. A gomba kórokozó a növényi sejtnek a poláris növekedésre való képességét használja arra, hogy az ép növényi sejtbe behatoljon anélkül, hogy a sejtmembránt károsítaná. Ezért a sejtpolaritás szabályozásának ismerete új lehetőséget adhat számunkra a kórokozókkal szembeni védekezésre, amellett, hogy jelentős ismeretekkel gyarapítja a növények fejlődéséről kialakított képünket.




Árpa RLCKVI_A típusú RBK1 kináz in vitro mielin bázikus fehérje (MyBP) foszforiláló aktivitása aktív (GTP-kötött) ROP GTPáz (CA RacB) jelenlétét igényli.



A KROMATIN-MEDIÁLT GÉNSZABÁLYOZÁS SZEREPE NÖVÉNYI TESTI SEJTEK TOTIPOTENSÉ VÁLÁSÁBAN

A kutatás rövid ismertetése

A kutatások célja azoknak a molekuláris mechanizmusoknak a feltárása, amelyek lehetővé teszik, hogy a növények differenciálódott testi sejtjei újra „totipotenssé” váljanak és a szomatikus embriógenezis (SE) útjára lépve belőlük teljes növények fejlődjenek. A projekt keretében optimalizálunk egy olyan sejt illetve szövettenyésztési rendszert, amely a modell növény Arabidopsis thaliana esetében is lehetővé teszi a folyamat kezdeti lépéseinek a vizsgálatát akár nagy áteresztő képességű molekuláris technikák alkalmazásával is. Ennek a felhasználásával azonosítani kívánjuk azokat a genomi régiókat melyek részt vesznek a szomatikus-embriogén fejlődési átmenetben, azaz inaktívak a testi sejtekben és aktívak a totipotens embriogén sejtekben. Feltételezzük, hogy a sejtek átprogramozódásában elsődleges szerepe van a kromatin átszerveződésének, ezért kutatásaink során a kromatin szerkezetét és ezzel összefüggésben a transzkripciós mintázatot, a kromatin állapotát jelző markereket és a növényi merisztémák/őssejtek fenntartásában szerepet játszó kulcs géneket fogjuk vizsgálni. Kutatásunk középpontjába a sejteknek azt az átmeneti „totipotens” állapotát helyezzük, melyet a növényi őssejtekre jellemző homeotikus gének (pl. WUS) expressziója jelez, mielőtt az embriogenezist közvetlenül szabályozó transzkripciós faktorok (pl. LEC1) még megnyilvánulnának. A projekt során azt is megvizsgáljuk, hogy a kromatin szerveződése milyen mértékben járul hozzá az egyes szövetek/genotípusok embriogén képességében megnyilvánuló különbségekhez. Kísérletet teszünk továbbá a kromatin szerkezet manipulálásával a SE képesség fokozására olyan esetekben, ahol ez a képesség nem nyilvánul meg vagy nem hatékony.

A kutatás fő kérdései

A növények regenerációs képessége rendkívüli: számos esetben a teljes növény egyetlen testi sejtből felnevelhető. Az ún. szomatikus embriógenezis során a differenciált testi sejt fejlődésbiológiai értelemben totipotenssé válik és embrióvá, majd növénnyé fejlődik. Annak ellenére, hogy ezt a jelenséget a gyakorlatban már sikeresen használják számos növényfaj esetében vegetatív szaporításra, a folyamat biológiai háttere még alig ismert. 2005-ben a Science magazin speciális kiadása felsorolta a tudomány 125 legfontosabbnak vélt megválaszolatlan kérdését. Ezek között szerepelt a „Hogyan lesz egy növény egyedi testi sejtjéből újra teljes növény?” kérdés is, jelezve a probléma általános tudományos jelentőségét. Ezt tovább fokozta az utóbbi években az a felismerés, hogy a növényi és állati „őssejtek” számos alapvető jellemzőben hasonlítanak egymásra. Ehhez az összehasonlításhoz is további adatokat kívánunk szolgáltatni.

Napjainkra elterjedté vált az a hipotézis, hogy a növények nagyfokú regenerációs képessége az epigenetikai információ kialakításában és fenntartásában szerepet játszó specifikus mechanizmusokon alapul. Kísérleteink célja ennek a hipotézisnek a megvizsgálása epigenetikus markerek és folyamatok tanulmányozásával a szomatikus embriogenezishez kapcsolódóan.

Míg a szomatikus embriogenezis jelenségét számos növény esetében sikeresen használják vegetatív szaporításra, más fajok/fajták esetében erre nincs lehetőség, mert az alkalmazott kezelésekre nem, vagy nem hatékonyan reagálnak. A projektben választ keresünk ennek a különbségnek a lehetséges epigenetikai hátterére és megkíséreljük a folyamat hatékonyságának növelését a kromatinszerkezet manipulálásával.

A kutatás jelentősége

Az Arabidopsis thaliana a növényi fejlődésbiológiai kutatások legelterjedtebben használt modell növénye, és így nagy mennyiségben állnak rendelkezésre a kutatása számára különféle mutáns, transzgenikus vonalak, markerek, génkonstrukciók, ellenanyagok és specifikus információk. Ezeknek a kihasználására a szomatikus embriogenezis kutatásában azonban eddig csak korlátozottan volt lehetőség, mert nem áll rendelkezésre egy igazán hatékony és rutinszerűen használható sejt- és szövettenyésztési kísérleti rendszer. Egy ilyen rendszer kidolgozásával szándékaink szerint sikeresen adhatunk választ azokra az eddig megválaszolatlan kérdésekre, hogy hogyan teszi lehetővé a kromatin és a génexpressziós mintázat átrendeződése az embriófejlődési program elindulását egy differenciált növényi sejtben és hogyan válhat egy testi sejt újra totipotenssé? Ez egy régóta és széles körben kutatott kérdés, amire a modern epigenetikai megközelítés adhat adekvát választ. A tervezett kutatások ezen túl adatokat szolgáltatnak a növényi és állati őssejtek létrejöttében és fenntartásában meglevő különbségek és hasonlóságok feltárásához is.

A kutatások eredménye gyakorlati alkalmazási lehetőségekhez is elvezethet. Míg a szomatikus embriógenezis jelenségét széles körben használják egyes növények vegetatív felszaporítására, addig más nagy gazdasági jelentőséggel bíró fajok esetében erre nincs lehetőség, mert differenciálódott sejtjeik nem vagy gyengén reagálnak a kezelésekre. A szomatikus embriógenezis lehetővé teszi a kiváló tulajdonságokkal bíró nemesítési alapanyagok, fajták, hibridek gyors vegetatív felszaporítását, fenntartását. Ennek során változatlanul megőrződik a hibridek, fajták, vonalak genetikai állománya, mert kiiktatódik az ivaros keresztezéssel összefüggő genetikai rekombináció. Továbbá, a genetikai módosításon alapuló modern növényi biotechnológiai megközelítések alapja szintén a növények in vitro regenerálása és felszaporítása. A kutatások kiszélesíthetik azoknak a növényeknek (fajoknak, genotípusoknak) a körét, melyek az alanyai lehetnek ezeknek a fejlesztéseknek.




A párhuzamos stressz és auxin válasz, a genotípus, valamint a kromatin-átrendeződés hipotetikus szerepe a szomatikus embriogenezis indukciójában.


Válogatott közlemények

A. Feher A , DB. Lajko, Signals fly when kinases meet Rho ¬of ¬plants (ROP) small G¬ proteins. Plant Science 237 (2015) 93.mildew and trichome branching. Plant Cell Rep. In press (2015). doi:10.1007/s00299-014-1725-1.

A. Fehér, Somatic embryogenesis - Stress-induced remodeling of plant cell fate. Biochim. Biophys. Acta. Special issue: Stress as a fundamental theme in cell plasticity. In press (2015). doi:10.1016/j.bbagrm.2014.07.005.

M. Domoki, A. Szűcs, K. Jäger, S. Bottka, B. Barnabás, A. Fehér, Identification of genes preferentially expressed in wheat egg cells and zygotes. Plant Cell Rep. 32 (2013) 339–48.

J. Bíró, I. Farkas, M. Domoki, K. Otvös, S. Bottka, V. Dombrádi, et al. The histone phosphatase inhibitory property of plant nucleosome assembly protein-related proteins (NRPs). Plant Physiol. Biochem. 52 (2012) 162–8.

C. Huesmann, T. Reiner, C. Hoefle, J. Preuss, M.E. Jurca, M. Domoki, et al. Barley ROP binding kinase1 is involved in microtubule organization and in basal penetration resistance to the barley powdery mildew fungus. Plant Physiol. 159 (2012) 311–20.

C. Fodor-Dunai, I. Fricke, M. Potocký, D. Dorjgotov, M. Domoki, M.E. Jurca, et al. The phosphomimetic mutation of an evolutionarily conserved serine residue affects the signaling properties of Rho of plants (ROPs). Plant J. 66 (2011) 669–79.

D. Dorjgotov, M.E. Jurca, C. Fodor-Dunai, A. Szűcs, K. Ötvös, É. Klement, et al. Plant Rho-type (Rop) GTPase-dependent activation of receptor-like cytoplasmic kinases in vitro. FEBS Lett. 583 (2009) 1175–82.

B. Barnabas, K. Jager, A. Fehér, The effect of drought and heat stress on reproductive processes in cereals. Plant. Cell Environ. 31 (2008) 11–38.

A. Fehér, K. Ötvös, T. Pasternak, A. Pettkó Szandtner, The involvement of reactive oxygen species (ROS) in the cell cycle activation (G 0 -to-G 1 transition) of plant cells, Plant Signal. Behav. 3 (2008) 823–826.

A. Fehér, The initiation phase of somatic embryogenesis: What we know and what we don’t, Acta Biol. Szeged. 52 (2008) 53–56.

M.E. Jurca, S. Bottka, A. Fehér, Characterization of a family of Arabidopsis receptor-like cytoplasmic kinases (RLCK class VI). Plant Cell Rep. 27 (2008) 739–48.

T.P. Pasternak, K. Ötvös, M. Domoki, A. Fehér, Linked activation of cell division and oxidative stress defense in alfalfa leaf protoplast-derived cells is dependent on exogenous auxin, Plant Growth Regul. 51 (2007) 109–117.

M. Domoki, J. Gyorgyey, J. Biro, T.P. Pasternak, A. Zvara, S. Bottka, et al. Identification and characterization of genes associated with the induction of embryogenic competence in leaf-protoplast-derived alfalfa cells. Biochim. Biophys. Acta. 1759 (2006) 543–51.

A. Fehér, Why Somatic Plant Cells Start to form Embryos?, in: A. Mujib, J. Samaj (Eds.), Somat. Embryog. Plant Cell, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 2005: pp. 85–101.

K. Ötvös, T.P. Pasternak, P. Miskolczi, M. Domoki, D. Dorjgotov, A. Szűcs, et al. Nitric oxide is required for, and promotes auxin-mediated activation of, cell division and embryogenic cell formation but does not in uence cell cycle progression in alfalfa cell cultures. Plant J. 43 (2005) 849–860.

A. Fehér, T.P. Pasternak, D. Dudits, Transition of somatic plant cells to an embryogenic state. Plant Cell, Tissue, Organ Cult. 74 (2003) 201–228.

T.P. Pasternak, E. Prinsen, F. Ayaydin, G. Potters, H. Asard, H.A. Van Onckelen, et al. The Role of Auxin, pH, and Stress in the Activation of Embryogenic Cell Division in Leaf Protoplast-Derived Cells of Alfalfa, Plant Physiol. 129 (2002) 1807–1819.