Kutatás - Biofizika Intézet - Molekuláris Neurobiológia Kutatóegység - Biológiai Barrierek Kutatócsoport

DELI Mária
tudományos tanácsadó

picture
VESZELKA Szilvia tudományos főmunkatárs
HOYK Zsófia tudományos munkatárs
KÜRTINÉ BOCSIK Alexandra tudományos munkatárs
WALTER Fruzsina tudományos munkatárs
HARAZIN András tudományos segédmunkatárs
MÉSZÁROS Mária tudományos segédmunkatárs
BARABÁSI Beáta Ph.D. hallgató
BARNA Lilla Ph.D. hallgató
GRÓF Ilona Ph.D. hallgató
SANTA MARIA Ana Raquel Marie Curie ösztöndíjas, Ph.D. hallgató
PORKOLÁB Gergő Szent-Györgyi diák

BIOLÓGIAI GÁTRENDSZEREK ÉS GYÓGYSZERBEJUTTATÁS

Háttér

Külső és belső gátrendszerek védik a szervezetet a károsító tényezőktől, és teremtenek szabályozott körülményeket az élettani működéshez. Ilyen barrier például a bél- és légzőrendszer hámja és az erek belső falát borító belhámsejt réteg. A barrierek védő működésének legfontosabb elemei az epitél- és endotélsejteket összekötő szoros kapcsolatok és a sejtmembránokban működő aktív pumpák, amelyek a káros idegen anyagokat, xenobiotikumokat tartják távol. Ugyanakkor ezek a barrierek gyógyszerek bejutását is nehezítik, mind a felszívódásukat a bélrendszerből a vérbe, mind az átjutásukat a vérből az idegrendszerbe, és ezzel számos betegség hatékony gyógyítását is megakadályozzák.

Gyógyszerek barriereken való átjutásának elősegítése

Hatóanyagok gátrendszereken való jobb átjuttatására keresünk és vizsgálunk új módszereket. Három alapvető stratégia áll rendelkezésre, amelyeket kísérletes úton is tanulmányozunk.


1. A hatóanyag módosítása: gyógyszerbejuttatás nanorészecskékkel

A hatóanyag megváltoztatása, például a kationos vagy lipofil tulajdonságának növelése régóta ismert eljárás a farmakokinetikai paraméterek javítására. A nanotechnológia fejlődése új lehetőségekkel bővítette a gyógyszerbejutattás fokozásának ezt a módját. Az SZTE Gyógyszertechnológiai Intézetével együttműködésben a gyulladáscsökkentő meloxikám nanonizált formáját vizsgáltuk (1. ábra). A nano-meloxikám jobb oldódását és epitélsejteken való gyorsabb átjutását írtuk le (Kürti és mtsai, 2013).



1. ábra: Pásztázó elektronmikroszkópos felvétel segédanyaggal együtt őrölt meloxikám nanorészecskékről.


Folyamatban lévő OTKA által támogatott (PD101206) vizsgálatunkban barriereken keresztüli célzott bejuttatás lehetőségét kutatjuk szállítófehérjék ligandjaival jelzett nanorészecskék felhasználásával.


2. A barrier módosítása: sejtközötti kapcsolatok megnyitása

A gátrendszerek sejtjeit a kapcsolófehérjék olyan szorosan kötik össze, hogy a paracelluláris útvonalon nincs szabad sejt- és anyagáramlás. A szoros kapcsolatok megnyitása egyik lehetséges útja a fokozott gyógyszerbevitelnek (Deli 2009). A paracelluláris út megnyitására rövidláncú alkilglicerolokat vizsgáltunk in vitro vér-agy gát modellen göttingeni partnereinkkel (Hülper és mtsai, 2013). Az alkilglicerolok az agyi endotélsejtek barrier tulajdonságait gyorsan és reverzibilis módon tudták csökkenteni (2. ábra). Másik megközelítésünk olyan peptidszekvenciák alkalmazása, amelyek a szoros kapcsolatok kapcsolófehérjéire hatva nyitják meg a paracelluláris utat epitél- és endotélsejteken. Vizsgáljuk a kemoterápiában adjuvánsként alkalmazott tezmilifén endotélsejtek barrier tulajdonságaira kifejtett hatását is.



2. ábra: Alkilglicerolok (2-O-HG, 1-O-PG) és mannitol hatása klaudin-5 immunfestés mintázatára tenyésztett agyi endotélsejteken. A csillagok a sejtréteg felszakadását jelzi. A festődés intenzitása a kezelés hatására a sejthatáron fragmentálódott és csökkent, a citoplazmában megnőtt. A hatás átmeneti volt, a kezelés megszűnte után fél órával a festődés visszaállt. Mérce: 25 µm. (Hülper és mtsai, 2013)



3. A barrierek “megkerülése” – alternatív beviteli kapuk

Az orron keresztül való gyógyszerbeviteli utat kétféleképpen is tanulmányoztuk. Egyrészt kimutattuk, hogy a hialuronsav tartalmú nazális beviteli forma jelentősen fokozni tudja mind egy modellanyag (Horvát és mtsai, 2009), mind biológiailag aktív peptidek bejutását az orrüregből különböző agyrégiókba (Sipos és mtsai, 2010), és ezzel megkerüli a vér-agy gátat, mint bejutást gátló barriert. Másrészt a nazális útvonalat, mint alternatív kaput használtuk a meloxikám hatékony bejuttatására a keringésbe (Kürti és mtsai, 2013).


Gátrendszerek sérülése kórállapotokban: védelmük, mint terápiás célpont

Másik fő kutatási irányunk a barrierek, köztük a vér-agy gát sérülésének vizsgálata különböző betegségekben, mint a cukorbetegség, az akut hasnyálmirigy-gyulladás, vagy az Alzheimer-kór. Célunk, hogy feltárjuk a betegségek létrejöttében kulcsfontosságú tényezők hatását a barrier működésére, és védőanyagokat azonosítsunk. Igazoltuk, hogy az Alzheimer-kór kialakulásában fontos szerepet játszó amiloid peptidszakaszok közvetlenül károsítják nem csak az ideg- és gliasejteket, hanem az agyi hajszálereket alkotó agyi endotél és pericita sejteket is. Ezt a hatást sikerült kivédeni a telítetlen zsírsav DHA alkalmazásával (Veszelka és mtsai, 2013). Jelenleg folyó kutatásainkban a metabolikus szindrómában és neurodegeneratív megbetegedésekben egyaránt kóroki szerepet játszó metilglioxál okozta sejtkárosító hatás ellen tesztelünk védőmolekulákat. A glia, endotél és pericita sejtek közötti interkaciót és a citokinek szerepét tanulmányozzuk epilepsziában in vivo és in vitro módszerekkel az MTA és a mexikói CINVESTAV által támogatott kétoldalú együttműködésünkben.


Sejtkárosító hatások széleskörű és valós idejű vizsgálata

Betegségekben szerepet játszó károsító tényezők, valamint hatóanyagok és gyógyszerészeti segédanyagok sejtes vizsgálatának első lépése a toxikus dózisok megállapítása. A standard kolorimetriás tesztek, mint a metabolikus aktivitást mérő MTT esszé és a membránkárosítást jelző enzimfelszabadulások (LDH teszt) mellett valós idejű, impedancián alapuló módszerrel (RTCA-SP, ACEA Biosciences) is mérjük a sejtek életképességét. Ezzel az új módszerrel tudtuk kimutatni, hogy a Cremophor EL és RH40 klinikailag is releváns koncentrációkban akutan az epitélsejteket nem, csak az endotélsejteket, míg hosszabb kezelésnél pedig mindkét barriert képes károsítani, ami megmagyarázhatja a Cremophor tartalmú gyógyszerekkel kapcsolatban leírt mellékhatásokat (Kiss és mtsai, 2013). A megfigyeléseket morfológiai vizsgálatokkal erősítettük meg (3. ábra).



3. ábra: Cremophor kezelés (24 óra) hatása klaudin-4 immunfestés mintázatára Caco-2 humán bélepitélsejteken. A festődés intenzitása a kezelés hatására a sejthatáron fragmentálódott és csökkent (nyilak), a citoplazmában megnőtt. A csillagok a sejtrétegek felszakadását jelzik. Kék: élő sejtek magja; piros: elpusztult sejtek magja; zöld: klaudin immunfestődés. CrEL, Cremophor EL; CrRH, Cremophor RH40; TX, Triton X-100. Mérce: 10 µm. (Kiss és mtsai, 2013)



Új tenyészetes modellek létrehozása barrierek komplex vizsgálatára

Kísérleteinkben az orrnyálkahártya, a tüdő és a bélepithelium, valamint a vér-agy gát tenyészetes modelljein vizsgáljuk a gyógyszerbejuttatás, valamint betegségek károsító hatása elleni védelem új lehetőségeit. Nem csak önálló sejtrétegeken kísérletezünk, hanem kettős és hármas ko-kultúra modelleket is létrehoztunk. Sikerült először kifejlesztenünk egy új vér-agy gát modellt agyi endotélsejtek, glia sejtek és periciták együtt tenyésztésével, ami alkalmas a vér-agy gát működésének vizsgálatára élettani, kóros és gyógyszerekkel befolyásolt körülmények között, valamint gyógyszer jelölt vegyületek agyba való bejutásának becslésére (Nakagawa és mtsai, 2009; szabadalom: WO/2007/072953). A gyógyszerek agyi penetrációjának becslésére használt endotél- és epitélsejtes modelleket részletes összehasonlító elemzését a közelmúltban végeztük el (Hellinger és mtsai, 2012). A Biofizikai Intézet egyik társcsoportjával, Dér Andrással és munkatársaival együttműködésben egy mikrofluidikai integrált chip modell előállításán dolgozunk, amely jelentős előrelépést jelentene a jelenleg használt statikus permeabilitási modellekhez képest.


Továbbfejlesztés, hasznosítás, felhasználás

A barrierek széleskörű vizsgálatára alkalmas új modellek fejlesztése az alapkutatási jelentősége mellett a gyógyszeripar számára is hasznosítható lehet. Az új gyógyszerbeviteli utak és lehetőségek feltárására valamint a gátrendszerek védelmére irányuló vizsgálataink hozzájárulhatnak egyes betegségek hatékonyabb kezeléséhez.

Válogatott közlemények

Nakagawa S, Deli MA, Kawaguchi H, Shimizudani T, Shimono T, Kittel A, Tanaka K, Niwa M. (2009) A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. NEUROCHEMISTRY INTERNATIONAL 54:(3-4) pp. 253-263.

Deli MA. (2009) Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-BIOMEMBRANES 1788:(4) pp. 892-910.

Deli MA, Veszelka S, Csiszar B, Toth A, Kittel A, Csete M, Sipos A, Szalai A, Fulop L, Penke B, Ábrahám CS, Niwa M. (2010) Protection of the Blood-Brain Barrier by Pentosan Against Amyloid-beta-Induced Toxicity JOURNAL OF ALZHEIMER'S DISEASE 22:(3) pp. 777-794.

Veszelka S, Tóth AE, Walter FR, Datki Z, Mózes E, Fülöp L, Bozsó Z, Hellinger É, Vastag M, Orsolits B, Környei Z, Penke B, Deli MA. (2013) Docosahexaenoic acid reduces amyloid β-induced toxicity in cells of the neurovascular unit. JOURNAL OF ALZHEIMER'S DISEASE 36:(3) pp. 487-501.

Hülper P, Veszelka S, Walter FR, Wolburg H, Fallier-Becker P, Piontek J, Blasig IE, Lakomek M, Kugler W, Deli MA. (2013) Acute effects of short-chain alkylglycerols on blood-brain barrier properties of cultured brain endothelial cells BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY 169:(7) pp. 1561-1573.

Tóth AE, Walter FR, Bocsik A, Sántha P, Veszelka S, Nagy L, Puskás LG, Couraud PO, Takata F, Dohgu S, Kataoka Y, Deli MA. (2014) Edaravone protects against methylglyoxal-induced barrier damage in human brain endothelial cells. PLOS ONE 9:(7) Paper e100152. 14 p.

Kiss L, Hellinger É, Pilbat A-M, Kittel Á, Török Z, Füredi A, Szakács G, Veszelka S, Sipos P, Ózsvári B, Puskás LG, Vastag M, Szabó-Révész P , Deli MA. (2014) Sucrose esters increase drug penetration, but do not inhibit P-glycoprotein in Caco-2 intestinal epithelial cells. JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES 03:(10) pp. 3107-3119.

Walter FR, Veszelka S, Pásztói M, Péterfi ZA, Tóth A, Rákhely G, Cervenak L, Ábrahám CS, Deli MA. (2015) Tesmilifene modifies brain endothelial functions and opens the blood-brain/blood-glioma barrier. JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY 134:(6) pp. 1040-1054.

Sántha P, Veszelka S, Hoyk Z, Mészáros M, Walter FR, Tóth AE, Kiss L, Kincses A, Oláh Z, Seprényi G, Rákhely G, Dér A, Pákáski M, Kálmán J, Kittel Á, Deli MA. (2016) Restraint stress-induced morphological changes at the blood-brain barrier in adult rats. FRONTIERS IN MOLECULAR NEUROSCIENCE 8: Paper 88. 15 p.

Bocsik A, Walter FR, Gyebrovszki A, Fülöp L, Blasig IE, Dabrowski S, Ötvös F, Tóth A, Rákhely G, Veszelka S, Vastag M, Szabó-Révész P, Deli MA. (2016) Reversible opening of intercellular junctions of intestinal epithelial and brain endothelial cells with tight junction modulator peptides. JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES 105:(2) pp. 754-765.

Helms HC, Abbott NJ, Burek M, Cecchelli R, Couraud P-O, Deli MA, Förster C, Galla HJ, Romero IA, Shusta EV, Stebbins MJ, Vandenhaute E, Weksler B, Brodin B. (2016) In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM 36:(5) pp. 862-890.

Walter FR, Valkai S, Kincses A, Petneházi A, Czeller T, Veszelka S, Ormos P, Deli MA, Dér A. (2016) A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. SENSORS AND ACTUATORS B-CHEMICAL 222: pp. 1209-1219.